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醫(yī)科院藥物所朱平團隊基于蛋白質(zhì)工程大幅提高紅豆杉來源酰基轉(zhuǎn)移酶對非天然底物的催化效率實現(xiàn)在煙草中通過非天然途徑高效生物合成紫杉醇

近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線發(fā)表了由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所朱平團隊撰寫的“Engineering of 10-Deacetylbaccatin III-10-β-O-Acetyltransferase From Taxus Species for Efficient Acetylating Non-Natural Substrates Into Taxol in Nicotiana benthamiana”論文。

該研究首先以高效乙酰化10-去乙酰紫杉醇（DT）到紫杉醇為目標，通過對紫杉醇天然合成途徑中的10-去乙酰巴卡亭-III-10-β-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶DBAT【其天然底物為10-去乙酰巴卡亭III（10-DAB）,產(chǎn)物為巴卡亭III】進行全局性蛋白質(zhì)工程改造，獲得了一系列對非天然底物DT的催化效率顯著提高的突變體，并闡釋其高效催化機制。接著，分別確證DBAT突變體和香菇來源的糖基水解酶LXYL-P1-2【該酶可高效催化紫杉醇結(jié)構(gòu)類似物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（XDT）為DT】均能在模式植物本氏煙草體內(nèi)實現(xiàn)功能性表達。進一步地，向瞬時轉(zhuǎn)染的煙草中飼喂DT或XDT（雙酶共表達），實現(xiàn)了以DT或XDT為前體的紫杉醇體內(nèi)高效生物合成。

這一研究結(jié)果，為紫杉醇的高效生物合成提供了一條新的途徑，并實現(xiàn)了對天然含量遠高于紫杉醇的XDT的高效利用，具有較為重要的經(jīng)濟價值、社會意義和環(huán)保意義。同時，一系列高活性突變體的獲得不僅為紫杉醇的生物合成提供了優(yōu)質(zhì)的元件，還為主動學(xué)習(xí)輔助的定向進化（ALDE）提供了可靠的濕實驗數(shù)據(jù)。此外，基于這項研究成果，未來還可開發(fā)上述兩個酶的轉(zhuǎn)基因煙草細胞系，嘗試通過大規(guī)模細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)紫杉醇。

紫杉醇是重要的一線抗腫瘤藥物，但其天然含量極低，在紅豆杉不同部位的含量僅為0~0.069%（干重）不等。如何充分利用紅豆杉資源并綠色、高效地獲得紫杉醇一直是人們關(guān)注的焦點。紫杉醇的生物合成過程復(fù)雜，且隨著對其生物合成酶的不斷發(fā)掘，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)紫杉醇的生物合成途徑不太可能遵循簡單的線性模式，而是構(gòu)成了一個復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，因而進一步增加了紫杉醇生物合成的整體復(fù)雜性。迄今為止，基于天然合成途徑的大多數(shù)紫杉醇合成生物學(xué)研究僅實現(xiàn)了中間體10-DAB或巴卡亭III的從頭生物合成，且其產(chǎn)量均遠不能維持下游生物合成途徑的需要。與之相對地，在紫杉醇提取過程中，常常能夠獲得一些天然含量遠高于紫杉醇的結(jié)構(gòu)類似物，其中以XDT為典型代表（~0.5%左右）。XDT僅通過C7位木糖基水解（LXYL-P1-2催化，生成DT）和C10位羥基乙?；―BAT催化）即可轉(zhuǎn)化為紫杉醇，但其轉(zhuǎn)化效率嚴重受限于DBAT對DT的催化效率。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所朱平團隊在前期研究中曾獲得DBATG38R/F301V突變體，該突變體與野生型DBAT相比其乙?；疍T的效率提高了約6倍（DOI: 10.1038/ncomms15544），但相比于DBAT對天然底物10-DAB的催化效率仍有很大的提升空間，另外該突變體較不穩(wěn)定。本研究通過虛擬飽和突變、計算篩選，DNA改組，以及迭代組合突變相結(jié)合的蛋白質(zhì)工程改造策略，獲得了一系列乙?；疍T效率得到進一步提高的突變體（其中突變體ICM9-6乙?；疍T的效率大約是野生型DBAT的16.4倍）。在確證LXYL-P1-2和ICM9-6均能在煙草中實現(xiàn)功能性表達的基礎(chǔ)上，通過向瞬時轉(zhuǎn)染的煙草飼喂XDT或DT，分別獲得3.6 μg g-1 FW（55.4 μg g-1 DW）或為8.2 μg g-1 FW（129.3 μg g-1 DW）的紫杉醇，該產(chǎn)量是迄今為止煙草體內(nèi)生物合成紫杉醇的最高水平（圖1）。

圖1

全文主要研究結(jié)果如下：

1. 活性口袋“熱點”氨基酸殘基的虛擬飽和突變和計算篩選

研究者以來源于東北紅豆杉的DBATcus作為研究對象，首先通過三維結(jié)構(gòu)模擬和優(yōu)化，獲得了高可信度的蛋白三維結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上與底物DT進行分子對接（圖2a）。分析對接結(jié)果并排除高度保守位點后，獲得了位于DT 5 ?范圍內(nèi)的37個“熱點”氨基酸殘基。對這37個位點進行虛擬飽和突變體的構(gòu)建和計算機篩選，從703個虛擬單點突變體中篩選到19個對DT催化活性最有可能提高的候選突變體。對其進行突變體構(gòu)建和細胞水平的活性初篩后，選擇了其中12個候選突變體進行蛋白水平的活性測定，最終獲得了4個對DT催化活性提高的單點突變體：P217K、E350M、S351D和S396G，催化DT的比活力分別是野生型DBATcus的2.9倍、2.8倍、2.8倍和3.9倍（圖2b，2c）。正突變的比例高達1/3。在最適反應(yīng)條件下（圖2d，2e），P217K、E350M、S351D和S396G的催化效率（kcat/Km）比DBATcus分別提高6.1倍、1.9倍、2.9倍和6.3倍（圖2f-2j）。這些結(jié)果顯示，計算機輔助的虛擬篩選方法可以有效地提高篩選效率。

圖2 DBATcus?；荏w底物口袋的虛擬篩選和活性測定

2. 不同紅豆杉來源DBAT的DNA改組

研究者通過分析不同紅豆杉來源的6種DBAT的蛋白序列和活性，發(fā)現(xiàn)了21個位于活性口袋之外、但與催化DT活性相關(guān)的氨基酸殘基（圖3a，3b）。為了集合優(yōu)勢突變位點、獲得催化DT活性提高的突變體，研究者對這6種DBAT進行了DNA改組實驗（圖3c）。通過基因重組獲得了約500個突變體，經(jīng)過層層篩選最終對其中17個突變體進行蛋白水平活性驗證（圖3c，3d），結(jié)果顯示有11個突變體催化DT活性與野生型DBATcus相比有所提高，實驗檢測陽性率高達64.7%（正文 Table S7）。其中有9個突變體的催化效率顯著提高，活性最高的突變體SF-181，其催化DT的比活力為野生型DBATcus的7.9倍（圖3e）。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了一個對催化活性十分重要的突變位點R345，僅對其進行R345C單點突變，即能將催化DT的比活力提高到7.4倍（圖3e）。這些結(jié)果表明，遠離活性中心的氨基酸殘基雖然不直接參與底物的催化，但也能顯著影響酶對底物的催化效率。

圖3 DNA改組突變體的構(gòu)建和活性測定

3. 高活性突變體的催化機制分析

在獲得上述單點突變體與改組突變體基礎(chǔ)上，研究者通過迭代組合突變，獲得了催化DT的效率與野生型相比提高16.4倍（kcat/Km: 24.43 vs. 1.49）的突變體ICM9-6。為了闡釋ICM9-6催化效率提高的機理，研究者對DBATcus/DT復(fù)合物和最佳突變體ICM9-6/DT復(fù)合物進行了分子動力學(xué)（MD）模擬。RMSF分析顯示ICM9-6中有四個區(qū)域柔性較高（L82-E91、L130-I136、K199-L214、T343-I357）（圖4a）。其中，loop K199-L214和loop T343-I357位于活性口袋的外圍。與野生型DBATcus相比（圖4c），loop K199-L214和loop T343-I357在ICM9-6中的柔性顯著增加（圖4b），從而使底物更容易進入活性口袋，最終顯著提高了催化DT的效率。

圖4 DBATcus/DT復(fù)合物和ICM9-6/DT復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬分析

(a) DBATcus和 ICM9-6 中每個殘基的α-碳的均方根波動（RMSF）值。ICM9-6（b）和DBATcus（c）中四個loop（L82-E91、L130-I136、K199-I224和T343-I357）的柔性示意圖。高柔性以紅色表示，低柔性以藍色表示?；钚钥诖械腄T底物以黃色棒狀顯示。

4. 在本氏煙草體內(nèi)以紫杉醇類似物為前體合成紫杉醇

鑒于DBATcus（及其突變體）和LXYL-P1-2在大腸桿菌（E. coli）、釀酒酵母（S. cerevisiae）、畢赤酵母（P. pastoris）和構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）系統(tǒng)中均未能實現(xiàn)功能性共表達，本研究將上述基因通過瞬時轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入本氏煙草，不僅確證了DBAT突變體和LXYL-P1-2均能在煙草體內(nèi)實現(xiàn)功能性表達，而且成功實現(xiàn)了DBATcus（及其突變體）與LXYL-P1-2的功能共表達，進而實現(xiàn)了以DT或XDT為前體的紫杉醇高效體內(nèi)生物合成（圖5）。飼喂XDT為底物時，紫杉醇產(chǎn)量為3.6μg g-1FW（55.4 μg g-1 DW）；飼喂DT為底物時，紫杉醇產(chǎn)量為8.2μg g-1FW（129.3 μg g-1 DW）。

圖5 本氏煙草中合成紫杉醇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所助理研究員陳天嬌博士為該論文第一作者，朱平研究員和楊金玲研究員為該論文的共同通訊作者。該研究工作得到了北京市自然科學(xué)基金、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程等項目的資助。