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中國科學(xué)院微生物研究所向華研究員團隊的文章“Reprogramming the endogenous type I CRISPR-Cas system for simultaneous gene regulation and editing in Haloarcula hispanica”于2022年3月17日在mLife 正式上線。

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mlf2.12010

導(dǎo)讀

目前已知CRISPR-Cas系統(tǒng)分為６種類型，其中Ｉ型系統(tǒng)分布最廣、數(shù)量最多?；贗型系統(tǒng)開發(fā)基因組編輯和基因調(diào)控工具，對于認識、開發(fā)和利用功能多樣的微生物或微生物菌群資源具有極其重要的意義。過去利用I型系統(tǒng)進行基因組編輯需要Cas3蛋白，而對靶基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控又需要敲除cas3基因，兩套系統(tǒng)無法兼容。中國科學(xué)院微生物研究所向華研究員團隊對I型CRISPR-Cas系統(tǒng)功能進行了深入系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)僅通過改造spacer長度，在不敲除cas3的情況下，利用I型系統(tǒng)可同時實現(xiàn)基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

背景介紹

微生物研究所向華研究員團隊對Ｉ型CRISPR-Cas系統(tǒng)從病毒高效獲取新spacer的引發(fā)適應(yīng)機制、異已區(qū)分機制、定點整合機制等有長期系統(tǒng)的研究。在此過程中，不僅發(fā)現(xiàn)了其spacer長度的多樣性，還發(fā)現(xiàn)改變spacer長度對引發(fā)適應(yīng)和干擾具有不同程度的影響，顯示出Ｉ型CRISPR-Cas系統(tǒng)突出的魯棒性和可塑性。特別值得強調(diào)的是，向華/李明團隊近期在I-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)基因簇內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了其前所未見的RNA型護衛(wèi)系統(tǒng)CreTA，提示了Ｉ型CRISPR-Cas系統(tǒng)對內(nèi)源性CreTA基因的天然調(diào)控機制。其中抗毒素CreA具有crRNA類似結(jié)構(gòu)，可以引導(dǎo)Ｉ型CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)復(fù)合物Cascade靶向結(jié)合到毒素CreT的啟動子區(qū)，從而抑制毒素的表達而不切割靶標基因（Science, 2021, 372(6541): eabe5601），暗示通過改變crRNA長度或結(jié)構(gòu)，在不敲除cas3的情況下，也能實現(xiàn)基因表達調(diào)控?；谏鲜鰡⑹?，該團隊系統(tǒng)研究了spacer長度對CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾、引發(fā)適應(yīng)和基因轉(zhuǎn)錄抑制功能的影響，并通過改造spacer長度，利用I型CRISPR-Cas系統(tǒng)同時實現(xiàn)了基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

科學(xué)發(fā)現(xiàn)

本研究以西班牙鹽盒菌的I-B型CRISPR系統(tǒng)為研究對象，系統(tǒng)研究了spacer長度對CRISPR功能的影響，包括干擾、引發(fā)適應(yīng)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當spacer長度從36bp縮短至30bp，CRISPR表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率提高了3個數(shù)量級，表明質(zhì)粒干擾現(xiàn)象消失。進一步以蕃茄紅素合成必須基因crtB為靶基因，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)改變spacer的長度（16-30bp），可以下調(diào)crtB基因的表達（菌落由紅變白，轉(zhuǎn)錄降低）（圖1）。

圖1 改變spacer長度實現(xiàn)對crtB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

(A)(C)西班牙鹽盒菌DF60(WT)及其敲除CRISPR序列的菌株（ΔCR），轉(zhuǎn)化不同長度spacer表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的顏色。(B)(D)熒光定量PCR測定crtB基因表達水平。pWL502為空質(zhì)粒對照。

為精細評價spacer在16-30bp范圍的功能效應(yīng)，該團隊通過全基因組深度測序和生長曲線測定，發(fā)現(xiàn)當spacer長度為28bp及以上時，靶基因仍有部分切割并且影響菌株的生長。但當spacer長度縮短至24bp，引發(fā)適應(yīng)消失，靶基因的切割現(xiàn)象也消失（圖2）。因此對于該菌，24bp是一個可安全用于基因調(diào)控的spacer長度。

圖2　確定24bp是轉(zhuǎn)錄抑制的安全spacer長度

(A) PCR測定不同spacer長度表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中靶序列的完整性。(B) 全基因組測序分析靶序列及其上下游各50kb區(qū)域的完整性。紅色箭頭指向靶序列位置。pV10C為對照質(zhì)粒。(C) 測定生長曲線。

基于以上研究，該團隊系統(tǒng)深入地揭示了spacer長度對CRISPR-Cas功能的調(diào)節(jié)作用并確定了功能調(diào)節(jié)關(guān)鍵邊界。對于該菌而言，36bp是其典型spacer長度，可用于基因組編輯；小于等于24bp的spacer則可以引導(dǎo)Cascade結(jié)合靶基因而又不激發(fā)干擾和適應(yīng)，可用于基因表達調(diào)控。為驗證上述理論，該團隊構(gòu)造了質(zhì)粒pDSBE，通過設(shè)計不同長度的spacer靶向不同基因，首次利用I型系統(tǒng)同時實現(xiàn)了靶基因的編輯（cdc6E精準敲除）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控（crtB抑制）（圖3）。

圖3 利用I型系統(tǒng)同時進行基因編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

pDSBE質(zhì)粒表達mini-CRISPR序列。U和D分別為cdc6E基因上下游同源臂。

總結(jié)展望

本研究揭示了spacer長度對I型CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)、干擾和轉(zhuǎn)錄抑制功能的調(diào)節(jié)，并基于此機制僅通過改變spacer長度，同時實現(xiàn)了基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。I型系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)分布最廣泛的CRISPR系統(tǒng)，本研究揭示的機制和提出的基因編輯與調(diào)控策略，有望推廣至更廣泛的擁有內(nèi)源性CRISPR系統(tǒng)的微生物類群，為包括眾多工業(yè)與環(huán)境微生物、病原菌在內(nèi)的模式菌或非模式菌提供了一種簡便高效的基因編輯和調(diào)控策略。

作者信息

第一作者

杜開心

作者單位：中國科學(xué)院微生物研究所

作者職稱：碩士研究生

作者簡介：2017級碩士，研究方向為CRISPR-Cas系統(tǒng)的遺傳機制。

通訊作者

龔路遙

作者單位：中國科學(xué)院微生物研究所

作者職稱：特別研究助理（博士后）

作者簡介：2020年于中國科學(xué)院大學(xué)（中國科學(xué)院微生物研究所）獲博士學(xué)位，現(xiàn)任向華研究組特別研究助理，研究方向為微生物免疫及基因組編輯工具開發(fā)。博士在讀期間，獲中國科學(xué)院院長優(yōu)秀獎、博士研究生國家獎學(xué)金等多個獎項。博士后期間入選中國科協(xié)青年人才托舉工程項目。相關(guān)工作以第一作者或共同一作在Nucleic Acids Res、Science等專業(yè)期刊上發(fā)表。

通訊作者

向華

作者單位：中國科學(xué)院微生物研究所

作者職稱：研究員，教授

作者簡介：中國科學(xué)院微生物研究所副所長，微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室主任，國家杰出青年科學(xué)基金獲得者，國家重點研發(fā)計劃項目首席科學(xué)家。兼任中國微生物學(xué)會秘書長、中國遺傳學(xué)會微生物遺傳專業(yè)委員會主任，中國生物工程學(xué)會合成生物學(xué)專業(yè)委員會副主任等；現(xiàn)任Front Microbiol、Front Genome Edit、mLife等期刊副主編，J Genet Genomics、Biology等期刊編委。致力于極端環(huán)境微生物遺傳與生理代謝、基因組編輯與合成生物學(xué)以及極端環(huán)境微生物組等研究，相關(guān)工作已在Science、Cell、Nat Commun、Nucleic Acids Res、Cell Rep、Biomaterials、Environ Microbiol等專業(yè)期刊發(fā)表論文130余篇