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1989年，化學(xué)生態(tài)學(xué)家Ian Baldwin發(fā)現(xiàn)，生長素的處理可以抑制抗蟲生物堿尼古丁的累積。其后，研究人員發(fā)現(xiàn)，生長素處理可以抑制尼古丁生物合成酶基因的表達(dá)。而且，通過煙草打頂提高煙堿含量的農(nóng)藝措施，被認(rèn)為和生長素的“去抑制”有關(guān)。但是30多年來，生長素抑制尼古丁的機制一直是個謎。

中國科學(xué)院昆明植物研究所的植物次生代謝分子調(diào)控研究組以野生二倍體煙草—漸狹葉煙草為材料，系統(tǒng)研究了生長素抑制尼古丁的分子機制，揭開了這個長期未解之謎。

實驗室前期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子NaERF1-like是調(diào)控尼古丁生物合成的關(guān)鍵因子。其基因編輯后，尼古丁合成關(guān)鍵限速酶NaPMTs和NaQPT2等的表達(dá)均顯著下調(diào)，尼古丁含量也隨之減少。相反地，在穩(wěn)定過表達(dá)植株中，尼古丁含量極顯著地增加。蛋白凝膠阻滯、染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶報告等實驗證明NaERF1-like通過直接結(jié)合在NaPMT1.1和NaQPT2啟動子上的GCC-box基序，激活NaPMT1.1和NaQPT2的轉(zhuǎn)錄活性。

非常有意思的是，NaERF1-like的表達(dá)能被生長素極顯著地抑制。這個結(jié)果表明，生長素極有可能通過抑制它的表達(dá)，并降低它對尼古丁合成酶基因的啟動活性，來達(dá)到抑制尼古丁的目的?；谶@個猜想，該團隊以NaERF1-like為誘餌，通過酵母雙雜篩庫的方法篩選獲得一個生長素反應(yīng)因子NaARF5。

NaARF5與NaERF1-like在蛋白水平上相互作用，這個結(jié)果得到了酵母雙雜交、GST pull-down、雙分子熒光互補實驗和熒光素酶蛋白互作實驗等手段的支持。

NaARF5的表達(dá)受生長素的顯著誘導(dǎo)，并在漸狹葉煙草根中高水平表達(dá)。CRISPR/Cas9敲除NaARF5可顯著增加NaERF1-like和NaPMTs等尼古丁合成相關(guān)基因的表達(dá)，并使葉片中尼古丁含量增加1.6-2.5倍。但是，過表達(dá)NaARF5則顯著抑制尼古丁合成相關(guān)基因表達(dá)及降低葉片尼古丁含量。

生長素處理后發(fā)現(xiàn)，尼古丁合成相關(guān)基因的表達(dá)及尼古丁的含量在NaARF5突變體材料中的表達(dá)顯著高于WT，說明NaARF5參與生長素對尼古丁生物合成的抑制過程。

最后，研究結(jié)果表明NaARF5不直接抑制尼古丁合成酶基因的表達(dá)。NaARF5通過和NaERF1-like相互作用，削弱NaERF1-like對NaPMT1.1和NaQPT2的調(diào)控。Dual-LUC、EMSA和ChIP-qPCR的實驗結(jié)果驗證了這個猜想。

綜上，NaERF1-like是漸狹葉煙草中調(diào)控尼古丁生物合成的關(guān)鍵因子，其表達(dá)被生長素顯著抑制。NaARF5負(fù)調(diào)控尼古丁生物合成。NaARF5一方面通過抑制NaERF1-like的表達(dá)，另一方面和NaERF1-like蛋白相互作用削弱了NaERF1-like對NaPMT1.1和NaQPT2的轉(zhuǎn)錄活性， 從而參與生長素對尼古丁生物合成的抑制過程。該研究成果揭示了生長素抑制尼古丁合成的分子機制，為生長素抑制植物防御反應(yīng)提供了新見解。

相關(guān)研究成果以Auxin-Induced Nicotine Inhibition Is Mediated by NaARF5 Through the Suppression of NaERF1-like Expression and Interaction With NaERF1-like in Nicotiana attenuata為題，在Plant Biotechnology Journal 上在線發(fā)表。中國科學(xué)院昆明植物研究所博士研究生楊米云為論文第一作者，佟阿慧為論文第二作者，吳勁松研究員和王蕾研究員為論文共同通訊作者。研究得到了云南基礎(chǔ)研究重大計劃(編號202401BC070015)等項目的支持。